Essais de viabilité cellulaire basés sur les microplaques utilisant la détection d’absorbance, de fluorescence ou de luminescence
Au moins un tiers des médicaments potentiels échouent de causes reliées à la toxicité, ce qui contribue aux coûts exorbitants de la R et D pharmaceutique, particulièrement si la toxicité est prouvée lors de tests cliniques. Donc, tester la toxicité de petites molécules est typiquement effectué de façon préclinique en utilisant des essais in vitro à base de cellules comme première étape d’identification des problèmes de toxicité.
Il y a plusieurs technologies d’essai disponibles commercialement pour tester la viabilité cellulaire où les effets négatifs provoquent une baisse du signal. Ces essais sont typiquement conçus pour les plans de travail et utilisent les microplaques et la détection optique caractéristique des lecteurs de microplaques. Dans ce bulletin technique, nous démontrons trois de ces technologies de viabilité cellulaire qui utilisent la détection de l’absorbance, la fluorescence ou la luminescence, toutes mesurées au moyen du lecteur économique multi-mode BioTek Synergy LX.
Matériels et méthodes
Expériences de toxicité
La lignée de cellules cancéreuses de la prostate humaine (PC-3) a été cultivée dans un milieu nutritif Hams F12K supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal et de pénicilline-streptomycine à 37°C à 5 % de CO2[1] . Les cultures ont été régulièrement traitées à la trypsine (0,05 % trypsine-EDTA) une fois à confluence de 80 %.
Les cellules ont été ensemencées dans des microplaques 96 puits Corning 3904 à parois noires à fonds transparents en utilisant le milieu DMEM/F12 sans phénol rouge afin de créer un total de 30 000 cellules par puits dans un volume de 100µL. Après 24 heures allouées pour l’adhésion, les composés cytotoxiques cycloheximide et tamoxifène ont été ajoutés aux cultures à différentes concentrations dans un volume de 100µL. Après 24 heures d’exposition, 100µL des milieux cellulaires ont été retirés et un réactif dilué a été ajouté selon les indications ci-dessous.
Test colorimétrique MTT
10µL du réactif d’essai de prolifération de cellules (12mM) Vybrant MTT (No Cat. V13154) a été ajouté. La réaction a été permise pendant quatre heures à 37°C dans un environnement humide. La réaction a été arrêtée et le produit l’insoluble (formazan) a été resolubilisé par addition de 100µL de SDS 10 % dans une solution de HCl 0,01 N puis incubé pendant 16 heures à 37°C dans un environnement humide. L’absorbance à 570nm a été mesurée par lecteur multi-mode Synergy LX en utilisant le monochromateur UV-Vis spécialisé.
Test fluorimétrique de Calcein AM
100µL de 5µM Calcein AM (No Cat. C34852) a été ajouté. Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 30 minutes, après lesquelles la fluorescence a été déterminée au moyen d’un lecteur Synergy LX en utilisant un cube à fluorescence verte. Ce cube a été configuré à l’aide d’un filtre d’excitation 485/20, un filtre d’émission 528/20, et un miroir dichroïque avec seuil de coupure à 510nm.
Essai luminescent CellTiter-Glo
100µL du réactif reconstitué de viabilité cellulaire CellTiter-Glo (No Cat. PR-G7572) a été ajouté. La plaque a été agitée sur un agitateur orbital pendant deux minutes, puis incubée pendant 10 minutes dans le noir à température de la pièce dans le lecteur Synergy LX avant de déterminer la luminescence avec un cube luminescent spécialisé. Ce cube permet le passage direct de la lumière du puits de la microplaque vers le détecteur PMT. Les paramètres par défaut pour un gain PMT (135) et temps de collecte (une seconde) ont été utilisés.
Expériences de titrage cellulaire
Pour les expériences de titrage cellulaires, une variété de concentrations des cellules PC-3 a été utilisée jusqu’à 36 000 cellules/puits. Après 24 heures, le réactif a été ajouté selon les indications du fabricant puis une lecture a été effectuée au moyen du lecteur Synergy LX en utilisant les modes de détection indiquées ci-dessus.
Résultats et discussion
Chacun des réactifs utilisés a sondé la santé des cellules de façon différente. L’essai colorimétrique MTT se fie à l’enzyme endogène NAD(P)H oxydoréductase afin de réduire le MTT afin de produire le colorant formazan. Le réactif Calcein AM est converti par des estérases endogènes cytoplasmiques d’un composé non fluorescent à un composé fluorescent. Le CellTiter-Glo est basé sur la quantification de l’ATP présente, ce qui indique la présence de cellules métaboliquement actives. Donc, pour chaque réactif, on s’attend à de plus grands signaux puisqu’il y a davantage de cellules viables présentes. Ceci est mis en évidence dans la Figure 1, qui indique le titre de cellules pour chaque technologie de détection testée.
Results and Discussion
Each of the reagents tested probes cell health, albeit in different ways. The colorimetric MTT assay relies on endogenous NAD(P)H oxidoreductase enzymes to reduce MTT to a colored formazan dye. The Calcein AM reagent is converted by endogenous cytoplasmic esterases from a non-fluorescent to a fluorescent compound. CellTiter-Glo is based on the quantification of ATP present, which indicates the presence of metabolically active cells. Thus, for each reagent, one would expect greater assay signals as more viable cells are present. This is evident in Figure 1, which demonstrates cell titrations for each of the detection technologies tested.

Dans le cas de l’expérience de toxicité dans laquelle la santé cellulaire est sondée après l’addition de petites molécules composées, on pourrait s’attendre à une réduction de signal pour chacune de ces technologies de détection si le composé démontre de la toxicité. L’étendue de la réduction dépend de comment les enzymes spécifiques associées à la génération du signal sont influencées, ou par l’activité métabolique des cellules dans le cas d’une mesure d’ATP. La Figure 2 illustre ces impacts lorsque les cellules sont traitées avec le cycloheximide et le tamoxifène.

Le cycloheximide est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour inhiber la synthèse de protéines dans les cellules eucaryotes étudiées in vitro. Ses effets toxiques se voient clairement dans la Figure 2, où pour chaque technologie, une baisse significative du signal est évidente avec l’augmentation de la dose du composé. Pour chaque technologie, le dose à la moitié du maximum de la réduction du signal est approximativement 0,1µM. Il faut aussi noter que l’étendue de la cytotoxicité semble plus grande pour les technologies de détection basées sur le renouvellement d’enzymes cytosoliques (MTT et Calcein AM) par rapport aux mesures d’ATP (CellTiter-Flo). Inversement, le tamoxifène démontre peu de toxicité sur toute sa plage de doses. Ce n’est pas inattendu puisque ce médicament est utilisé à grande échelle pour traiter le cancer du sein.
Conclusions
Le lecteur multi-mode Synergy LX est une solution économique pour les technologies de détection les plus communes utilisées dans la recherche en sciences de la vie, incluant l’absorbance, la fluorescence et la luminescence. Nous avons démontré ici ses utilités afin de quantifier la toxicité cellulaire au moyen des essais de viabilité cellulaire largement utilisés avec ces modes communes de détection.

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