Imagerie et analyse confocale à l’aide de l’Agilent BioTek Cytation C10
Depuis 2012, des cellules et des tissus provenant de nombreuses sources sont cultivés en trois dimensions (3D), ce qui permet de créer des modèles biologiques plus complexes. L’utilisation de ces modèles 3D s’est accrue dans la recherche médicale, la médecine de précision, la modélisation des maladies et les efforts de découverte de médicaments.
Ces modèles 3D sont utilisés pour simuler les micro-environnements natifs des organismes et sont censés fournir un modèle d’essai plus précis dans certains cas. Les modèles 2D, constitués d’une monocouche de cellules, sont utilisés depuis des décennies et ont fourni de nombreuses données significatives.
Cependant, les limites de la 2D sont devenues plus apparentes avec le développement récent d’organoïdes, de tissus ou de tumoraux complexes. Ces tissus, constitués d’un ou plusieurs types de cellules et souvent basés sur des cellules souches ou des échantillons dérivés de patients, font désormais l’objet de nombreuses études.
Le Cytation C10
La possibilité d’effectuer une variété de tests sur un seul instrument compact est avantageuse, en particulier compte tenu de l’espace limité sur les paillasses de nombreux laboratoires. Le lecteur d’imagerie confocale Agilent BioTek Cytation C10 peut effectuer la lecture de microplaques, l’imagerie grand champ et l’imagerie confocale, offrant ainsi les moyens de recueillir des données pour les études complexes actuelles.
La note d’application Agilent « Confocal Imaging and Analysis of Spheroids for Determination of Dose Response During Drug Treatment » de Peter J. Brescia décrit l’utilisation de l’imagerie automatisée pour déterminer le nombre de cellules dans les sphéroïdes afin d’évaluer les réponses aux doses de médicaments.
Matériel et méthodes d’étude
L’étude discutée dans la note d’application a utilisé des cellules CT116-H2B-GFP; la construction H2B-GFP a fourni un marqueur nucléaire à expression constitutive pour la quantification par comptage de cellules pour la comparaison avec une coloration nucléaire pendant l’analyse de cellules vivantes.
Les cellules ont été ensemencées à une densité relativement faible de 500 cellules/puits dans une plaque d’imagerie ULA à 96 puits et à fond rond (N° de cat. 15-100-173) et cultivés pendant trois à quatre jours pour produire des sphéroïdes d’une taille d’environ 100 µm.
La staurosporine, un inhibiteur puissant et non sélectif de la protéine kinase, a été ajoutée pour induire l’apoptose. De l’iodure de propidium (IP) a également été ajouté pour surveiller la cinétique et déterminer le moment optimal (12 heures après l’ajout ont produit une activité apoptotique suffisante pour l’analyse).
Procédure d’imagerie et analyse de l’étude
Pour minimiser l’ensemble des données, les sphéroïdes ont été dimensionnés pour être capturés dans un seul champ de vision (objectif 20X) et une balise a été utilisée pour corriger la variabilité du positionnement dans les puits. Un disque rotatif à trou d’épingle de 60 µm a fourni un compromis entre le temps d’acquisition et l’intensité du signal pour l’imagerie confocale le temps d’acquisition et l’intensité du signal pour l’imagerie confocale. Des images grand champ ont été capturées dans les canaux GFP et TRITC pour les comparer aux images confocales.
L’instrument a été réglé sur « Scan », suivi de « Autofocus », qui a identifié le centre approximatif du sphéroïde le long de l’axe Z. Chaque sphéroïde a été capturé en tant que pile z en utilisant 11 étapes à 10 µm, indépendamment de la position Z dans le puits. Les images ont été traitées en plusieurs étapes, y compris une projection en Z pour comparer les images d’un seul plan Z au centre approximatif du sphéroïde et la pile Z entière pour les deux modes d’imagerie.
Le comptage automatisé des cellules a été effectué en utilisant le mode d’imagerie confocale et grand champ et les images projetées en plan simple et en pile Z ont été analysées.
Figure 1. Flux de travail du dosage des sphéroïdes incorporant l’acquisition et l’analyse d’images automatisées (lecteur d’imagerie confocale Agilent BioTek Cytation C10 et lecteur de microplaques Agilent BioTek Gen5 et logiciel d’imagerie).
Figure 2. Sphéroïde capturé comme une pile Z en utilisant 11 étapes à des intervalles de 10 µm. Analyse effectuée soit sur une projection en Z de toutes les images, soit sur une seule image représentant un plan passant par le centre du sphéroïde.
Figure 3. Exemples d’acquisition d’images automatisée et d’analyse du nombre de cellules de sphéroïdes par microscopie confocale et fluorescente à grand champ utilisant des images projetées en Z. Masquage des cellules (contours jaunes) où le nombre de cellules GFP indique les cellules vivantes et PI les cellules mortes.
Figure 4. EC 50 déterminations pour chaque mode d’imagerie, images simples et images projetées en Z.
Les sphéroïdes étant de plus en plus utilisés pour représenter les micro-environnements complexes des systèmes biologiques, la possibilité d’automatiser la capture d’images à l’aide de plusieurs modes d’imagerie et d’effectuer une analyse automatisée des images peut augmenter le débit et permettre une analyse comparative.
Les résultats de l’étude ont confirmé que l’optique confocale permet une segmentation plus précise des cellules marquées dans les échantillons sphéroïdes que l’optique grand champ. La détermination du nombre de cellules à l’aide d’une seule image dans le plan Z a donné des résultats comparables aux méthodes reposant sur l’acquisition et le traitement d’images dans le plan Z.
Cette étude n’est qu’un exemple de l’utilité et de la flexibilité du lecteur d’imagerie confocale Cytation C10 d’Agilent BioTek et du logiciel de lecture et d’imagerie de microplaques Gen5 d’Agilent BioTek pour capturer et analyser plusieurs ensembles de données parallèles.
