Votre guide pour la cryoconservation des cellules
La cryoconservation des cellules met les lignées cellulaires en animation suspendue, ce qui arrête efficacement le temps biologique. Bien que cela puisse sembler de la science-fiction, la cryoconservation est un processus méticuleux et fondamental de la culture cellulaire qui exige la plus grande précision et le plus grand soin.
Alors, comment fonctionne la cryoconservation des cellules? Décomposons le processus.
Étape 1 : Sélectionner les cellules
La cryoconservation optimale se produit lorsque les cellules sont dans la meilleure condition possible et près de la fin de leur phase de croissance logarithmique.
Examinez soigneusement vos cultures pour détecter des signes de contamination microbienne. La croissance de cultures pour plusieurs passages dans un milieu sans antibiotique avant les tests peut amener des contaminants qui n’ont pas pu être détectés à un niveau plus détectable.
Examinez vos échantillons au microscope et la culture directement pour détecter la présence de bactéries, de levures, de champignons et de mycoplasmes. Les mycoplasmes présentent des problèmes uniques, parce qu’ils ne sont pas détectés pendant les tests. Vous devrez également tester à nouveau les stocks de culture après les avoir congelés.
Étape 2 : Récolter les cellules
Récoltez les cellules en suivant la procédure convenant au type de cellule et soyez aussi délicat que possible. Une fois les cellules récoltées, lavez ou inactivez tout agent dissociant susceptible d’endommager les cellules. Pour cette étape, utilisez une centrifugeuse uniquement si cela est absolument nécessaire et exercez une force faible, juste assez pour produire une pastille molle.
Mettez en commun le contenu des récipients de culture récoltés afin d’assurer l’uniformité du stock congelé final. Diluez ou concentrez la suspension cellulaire au besoin pour obtenir deux fois la concentration souhaitée.
Gardez les cellules au frais pour ralentir le métabolisme cellulaire et éviter l’agglutination. Les cellules peuvent être gazées avec du dioxyde de carbone lorsque cela est nécessaire pour empêcher les variations de pH alcalines.
Étape 3 : Choisir le contenant
La sélection des agents cryoprotecteurs appropriés peut réduire les dommages cellulaires pendant la cryoconservation. Le récipient d’entreposage approprié est également essentiel. Un mauvais récipient d’entreposage crée de nombreux risques, y compris des blessures, des dommages aux récipients et la contamination ou la perte de stocks congelés.
Les ampoules en verre thermoscellables et les flacons à bouchon à vis en polypropylène (avec filetage interne ou externe) sont les plus couramment utilisés. Cependant, les problèmes de scellage avec les ampoules font en sorte que les chercheurs et les professionnels de l’industrie préfèrent de plus en plus les tubes cryogéniques.
Étape 4 : Refroidir les cellules
La vitesse de refroidissement doit être ininterrompue, suffisamment lente pour donner le temps aux cellules de se déshydrater, et assez rapide pour prévenir les dommages dus à la déshydratation. Pour la plupart des cultures cellulaires animales, la vitesse de refroidissement idéale est une baisse constante de 1 °C à 3 °C par minute. Les cellules plus grandes ou moins perméables pourraient avoir besoin d’être refroidies plus lentement parce qu’elles prennent plus de temps à se déshydrater.
Certains laboratoires utilisent des unités de refroidissement électroniques programmables, qui permettent un contrôle précis du processus de congélation et produisent des résultats uniformes et reproductibles. D’autres utilisent des unités mécaniques qui offrent des contrôles de processus suffisants à moindre coût. Les congélateurs Ultracold avec boîtes en mousse de polystyrène isolées sont l’une des méthodes les plus économiques et les plus communément utilisées de refroidissement des lignées cellulaires. Un contenant Corning CoolCell, associé à un congélateur -80 °C, offre des profils de congélation cohérents et reproductibles.
Étape 5 : Stocker les cellules
Une fois que les cellules sont congelées, vous devez agir rapidement. Utilisez un récipient isolé rempli de glace sèche ou d’azote liquide pour transférer le stock congelé vers un stockage permanent.
La rapidité est la clé pour empêcher les flacons de se réchauffer et d’endommager les cellules. Même une augmentation temporaire de la température peut causer des dommages. La plupart des laboratoires de culture cellulaire utilisent des congélateurs à azote liquide, mais la caractéristique la plus importante de tout emplacement de stockage permanent est la capacité de maintenir de manière fiable des températures inférieures à -130 °C.
Étape 6 : Dégeler les cellules
Alors que le refroidissement des cellules doit être progressif, c’est l’inverse pour la décongélation des cellules. La décongélation rapide réduit la formation de cristaux de glace qui endommagent l’intérieur des cellules lorsqu’elles se réhydratent. Placez votre récipient dans de l’eau chaude et remuez-le doucement jusqu’à ce qu’il soit complètement décongelé. Pour la plupart des cultures cellulaires, une décongélation pendant 60 à 90 secondes à 37 °C permet d’obtenir les meilleurs résultats.
Étape 7 : Laisser les cellules récupérer
Retirez les agents cryoprotecteurs des cellules aussi rapidement et délicatement que possible afin d’éviter tout dommage résultant d’une exposition prolongée à ces agents. La méthode de retrait des agents cryoprotecteurs dépend du type d’agent et du type de cellule. Les cellules sensibles aux agents cryoprotecteurs nécessitent une centrifugation légère pour retirer l’agent. Si le cryoprotecteur est du glycérol, les cellules peuvent être endommagées par l’ajout soudain d’un grand volume de médium frais à la suspension cellulaire décongelée. Au lieu de cela, faites passer les cellules conservées au glycérol par plusieurs dilutions par étapes pour donner aux cellules le temps de s’ajuster. Utilisez des volumes égaux de milieux chauds toutes les 10 minutes.
En général, la plupart des cellules se rétablissent normalement si l’agent cryoprotecteur est retiré dans les six à huit heures suivant la décongélation par changement de milieu.
Lorsqu’elles sont conservées avec succès, les cellules congelées ont besoin de peu d’entretien et peuvent être une bouée de sauvetage si vous perdez des cultures cellulaires à cause d’une contamination ou d’un accident. Les cultures cellulaires congelées sont particulièrement utiles pour les expériences à long terme, car leur animation suspendue garantit que les variantes biologiques sont minimales.
Cryopreservation of cells puts your cell lines in suspended animation, stopping biological time for your cell cultures.
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