Thermo Scientific™ Pierce™ Kit Magnétique IP/Co-IP à liaison croisée

Caractéristiques du kit IP magnétique à liaison croisée IP/Co-IP :

• L’anticorps IP—sans anticorps est irréversiblement attaché aux billes magnétiques, ce qui entraîne une co-élution négligeable de l’anticorps intact ou des chaînes lourdes et légères avec l’antigène purifié
• Pratique—, le kit IP/co-IP contient des billes magnétiques et tous les tampons essentiels pour une immunoprécipitation optimale
• Réticulation rapide—complète et immunoprécipitation en moins de 3 heures
• Un immunoprécipit efficace—avec la moitié du volume recommandé de particules magnétiques comparé à d’autres billes magnétiques
• Des billes magnétiques compatibles—couplées à la protéine recombinante protéine A/G assurent la compatibilité avec la plupart des anticorps primaires, qu’ils soient de souris ou de lapin
• Les mesures évolutives—utilisent uniquement la quantité d’anticorps nécessaire pour une seule expérience IP ou préparent une plus grande quantité de billes magnétiques réticulées par anticorps pour plusieurs expériences

Le protocole du kit magnétique Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP lie l’anticorps IP aux billes magnétiques de la protéine A/G (Catalogue #88802) puis relie covalemment l’anticorps aux billes à l’aide de disuccinmidyl subérat (DSS) (Catalogue #21655). Les billes reticulées par anticorps sont ensuite incubées avec un lysat cellulaire ou un extrait tissulaire contenant l’antigène protéique d’intérêt, permettant la formation du complexe antigène :anticorps. Les billes sont lavées pour éliminer le matériau non lié et un tampon d’élution à faible pH est utilisé pour dissocier l’antigène lié des billes reticulées par anticorps. Un tampon de neutralisation est inclus pour prévenir la précipitation de l’antigène isolé et assurer l’activité des protéines dans les applications en aval. Le tampon d’échantillons de marqueurs de voie est inclus pour préparer les échantillons destinés à l’analyse SDS-PAGE. Le protocole est optimisé pour 2 à 10 μg d’anticorps IP. Pour des rendements optimaux en co-IP, utilisez 5 à 10 μg d’anticorps. Les billes sont retirées manuellement de la solution à l’aide d’un support magnétique ou par automatisation avec un instrument comme l’instrument Thermo Scientific KingFisher Flex.

La IP traditionnelle (sans attache d’anticorps covalents) offre généralement des rendements d’antigènes plus élevés que les protocoles IP utilisant la réticulation. Cela s’explique par le fait que le processus de réticulation entraîne inévitablement la perte de certains sites de liaison d’anticorps fonctionnels. Pour surmonter cette limitation avec la méthode de réticulation, il peut être nécessaire d’utiliser des quantités un peu plus importantes d’anticorps IP dans la méthode IP de liaison croisée que dans la procédure IP traditionnelle équivalente. Bien sûr, l’avantage de la procédure d’immunoprécipitation réticulante est l’absence de Western blots sans bandes d’anticorps interférantes.

Résumé du protocole

1. Prélave les billes avec un tampon de couplage 1X.
2. Liez l’anticorps aux billes magnétiques de la protéine A/G pendant 15 minutes.
3. Lavez les billes trois fois avec un tampon de couplage 1X.
4. Reliez l’anticorps aux billes avec le DSS pendant 30 minutes.
5. Laver la bille trois fois avec Elution Buffer, puis deux fois avec IP Lysis/Wash Buffer.
6. Incubez le lysat cellulaire avec des billes préparées pendant 1 à 2 heures à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
7. Laver les billes deux fois avec IP Lysis/Wash Buffer, puis une fois avec de l’eau purifiée.
8. Antigène lié à l’élu.

Produits connexes

Pierce™ Crosslink IP Kit (Catalogue #26147)