Le parcours sur la conception des panels de cytométrie en flux
La conception du panel est l’une des parties les plus cruciales d’une expérience de cytométrie en flux. Il s’agit de sélectionner la bonne combinaison de marqueur et de fluorochrome pour une population de cellules donnée. Mais un panneau mal conçu peut entraîner un chevauchement des spectres d’émission, entraînant une perte de résolution des populations cellulaires. Le choix d'un fluorochrome dépend de plusieurs facteurs, notamment du niveau d'expression de l'antigène, des longueurs d'onde d'émission et d'absorption, des réglages du laser et de l'instrument, et de la biologie liée à l'expérience.
Il est très important pour quiconque commence à explorer la cytométrie en flux de comprendre les principes de conception des panels et de les mettre en œuvre correctement. Bien qu'une grande partie de ce travail provienne d'essais et d'erreurs, une connaissance pratique de ces principes, ainsi que des lasers, des fluorochromes et de la conception des panels peut contribuer à simplifier considérablement la courbe d'apprentissage. La meilleure façon d'acquérir ces connaissances est d'écouter les experts du domaine et d'apprendre de leur expérience.
La cytométrie en flux multicolore est un moyen puissant de permettre l’analyse simultanée de plusieurs marqueurs au niveau d’une seule cellule. Avec l'augmentation des paramètres détectables, la conception d'un panel multicolore peut s'avérer difficile et nécessite la compréhension de plusieurs facteurs susceptibles d'influencer les performances du panel :
- Biologie : Densité d'antigène et co-expression
- Fluorochrome : Luminosité et débordement
- Instrument : Configuration et mise en place
Cliquez sur ici (PDF, 12,7 Mo) pour découvrir des panels préconçus.
Étape 1 : Définissez votre hypothèse expérimentale
C'est la première étape dans la conception de panels (PDF, 2,6 Mo). Commencez par identifier :
- Les informations biologiques que vous souhaitez recueillir
- La ou les populations de cellules que vous souhaitez examiner
- Définir si les cibles se trouvent à la surface des cellules ou à l'intérieur des cellules
Étape 2 : Sélection de marqueur
Au cours de la deuxième étape du processus de conception du panel, vous devrez déterminer les marqueurs et le nombre de marqueurs dont vous aurez besoin pour identifier la population visée.
Faire attention à :
- Niveaux d'expression des marqueurs
- Antigène primaire : Exprimé à haute densité, il définit souvent les lignées.
- Antigène secondaire : Souvent exprimé sur un continuum
- Antigène tertiaire : Marqueurs critiques exprimés à faible densité
- Coexpression des marqueurs, en particulier les marqueurs de faible intensité
- La stratégie de sélection nécessaire pour identifier la (les) population(s) de cellules que vous envisagez d'interroger.
Étape 3 : Connaître votre cytomètre en flux
Il est essentiel de connaître votre instrument et de bien comprendre sa configuration pour déterminer le nombre de marqueurs et les fluorochromes qu'il peut détecter.
Vous devriez tenir compte des éléments suivants :
- La longueur d'onde du laser pour l'excitation
- Le nombre de détecteurs pour chaque laser
- Les filtres disponibles pour détecter les fluorochromes
Étape 4 : Affectation des fluorochromes
Sélectionnez soigneusement les fluorochromes pour détecter les marqueurs à tous les niveaux d'expression afin de minimiser le chevauchement spectral. Envisagez des outils tels que le classement de la résolution des fluorochromes et les visionneuses de spectre pour faciliter l'évaluation :
- Résolution fluorochrome
- Excitation laser croisée
- Débordement de fluorochrome
N'oubliez pas d'associer les fluorochromes brillants aux antigènes à faible expression et les fluorochromes sombres aux antigènes à forte expression. Gardez à l'esprit que la propagation n'a d'impact que sur la résolution des marqueurs co-exprimés.
Étape 5 : Revoir le panel
Passez en revue la conception de votre panel et commencez à commander vos réactifs. N'oubliez pas de titrer vos réactifs et d'optimiser votre protocole de coloration. Inclure des contrôles appropriés pour la compensation et le FMO, ainsi que des contrôles biologiques pour garantir une performance optimale du panel.
Visitez le site fishersci.ca/bdbiosciences pour en savoir plus.
