Thermo Scientific™ L-photo-leucine

Thermo Scientific La L-Photo-Leucine et la L-Photo-Méthionine sont des analogues des acides aminés L-Leucine et L-Méthionine qui possèdent des chaînes latérales de diazirine activables capables de se réticuler chimiquement avec des molécules adjacentes lorsqu’elles sont exposées à la lumière ultraviolette. Comme leurs homologues naturels, ces acides aminés photo-réactifs peuvent être incorporés endogènement dans la séquence primaire des protéines lors de la synthèse. Les domaines d’interaction protéine-protéine impliquant les protéines synthétisées dans leur environnement naturel peuvent alors être réticulés de façon covalente en activant les groupes diazirine. Les expériences traditionnelles de réticulation impliquent l’ajout de réticulants chimiques bifonctionnels et de solvants réactifs associés, ce qui peut nuire à la biologie cellulaire étudiée. L’utilisation d’acides aminés photo-réactifs minimise ces effets potentiellement indésirables et permet d’étudier et de caractériser les interactions protéiques stables et transitoires dans les cellules avec un haut degré de confiance. Lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec des milieux cellulaires limitants spécialement formulés, dépourvus de leucine et de méthionine, les dérivés photo-activables sont traités comme des acides aminés naturellement présents par la machinerie de synthèse des protéines. En conséquence, ils peuvent être remplacés par la leucine ou la méthionine dans la séquence primaire des protéines. Lorsqu’ils sont exposés à la lumière UV, les cycles de diazirine deviennent des intermédiaires réactifs qui forment des liaisons covalentes avec les chaînes latérales et les colonnes vertébrales protéiques voisines. Les partenaires de liaison naturellement associés sont alors instantanément piégés. Les complexes protéiques réticulés sont détectés par une mobilité réduite sur SDS-PAGE, suivie de la détection par Western blot, chromatographie par exclusion de taille, sédimentation par gradient de densité de saccharose ou spectrométrie de masse.

Points clés :

• Le marquage – in vivo incorpore le groupe photo-réactif dans les protéines à l’aide de machines cellulaires normales

• La réticulation – in vivo permet de trouver des protéines interagissant dans l’environnement cellulaire naturel

• Plus de spécificité comparée aux méthodes – traditionnelles : les protéines interagissant en lien croisé sont correctement positionnées à leurs interfaces au sein des domaines d’interaction protéique

• Complémentaire aux méthodes – traditionnelles permet une caractérisation détaillée des interactions protéiques comparées aux résultats avec le formaldéhyde et d’autres approches plus générales de réticulation

• Récupération – efficace à 90% des protéines dans les lysats cellulaires après réticulation

• Protéines réticulées compatibles – exprimées dans une grande variété de lignées cellulaires, dont HeLa, 293T, COS7, U2OS, A549, A431, HepG2, NIH 3T3 et C6

• Les réactifs faciles à utiliser – sont photo-stables sous un éclairage normal de laboratoire, éliminant ainsi le besoin de travailler dans le noir