Applied Biosystems™ Exonucléase I, concentration standard, (10 unités/μL)

Description :

L’exonucléase I hydrolyse l’ADN simple brin dans la direction 35′ →′, libérant

5-mononucléotides′ et laissant intact le 5-dinucléotide′ terminal. L’hydrolyse est processive et ne peut pas se poursuivre si la 3e′ extrémité est phosphorylée. L’exonucléase I peut être utilisée pour mesurer la clivage endonucléolytique d’un ADN circulaire simple brin covalentement fermé réagissant avec une endonucléase d’intérêt. De plus, l’activité de l’hélicase d’ADN peut être mesurée à l’aide de l’exonucléase I.

L’exonucléase I est particulièrement utile pour préparer les produits de la PCR pour des applications impliquant des méthodes de séquençage ou de marquage. Typiquement, l’excès d’amorces et tout autre ADN simple brin superflu présent dans les produits PCR interféreront avec les réactions enzymatiques ultérieures impliquant la synthèse de l’ADN. Les propriétés hydrolytiques de l’exonucléase I dégradent tout l’ADN simple brin présent dans le mélange PCR, permettant à ce produit d’être utilisé plus efficacement dans d’autres applications. Lorsqu’elle est combinée avec la phosphatase alcaline de crevettes (PN 78390) pour la déphosphorylation du dNTP, l’utilisation de méthodes alternatives de purification, telles que les colonnes, les gels ou les séparations magnétiques, est complètement éliminée.

Pour le nettoyage PCR avec Exonucléase I, voir le USB ExoSAP-IT protocole. L’achat de ExoSAP-IT fournit une licence pour les méthodes de nettoyage par PCR utilisant l’exonucléase I et SAP.

Propriétés :

Poids moléculaire : 55 kDa

Inactivation thermique : 80 °C pendant 15 minutes.

Se dégrade en dinucléotides terminaux.

Dégrade l’ADN glycosylé.

Température optimale : 37 °C

Pureté :

Plus de 95% de pureté telle que déterminée par la SDS-PAGE. Testé pour des endonucléases contaminantes, des exonucléases double brin et des ribonucléases.

Tampon de stockage :

20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM 2-mercaptoéthanol, 0,5 mM d’EDTA, 50% de glycérol.

Conditions du test :

Le mélange réactionnel (100 μL) contient 67 mM de tampon de glycine (pH 9,5), 10 mM
de 2-mercaptoéthanol, 6,7 mM de MgCl₂, 0,5 mM d’ADN dénaturé et de l’enzyme. L’incubation est à 37 °C pendant 30 minutes.

Définition de l’unité :

Une unité est la quantité d’enzyme qui catalyse la libération de 10 nmol de nucléotide soluble en acide à partir de l’ADN dénaturé en 30 minutes à 37 °C dans des conditions standard.

Concentration :

Standard Conc. : 10 unités/μL, PN 70073

Haute concentration : 20 unités/μL, PN 72073

Analyse fonctionnelle : Produit PCR traité avec de l’exonucléase I pour dégrader les amorces non incorporées avant d’effectuer la réaction de séquençage avec le kit de séquençage polymérase ADN Séquencelase™  Version 2.0 (PN 70170).

Références :

GOLDMARK, P. J. ET LINN, S. (1972) J. Biol. Chimie. 247, 1849-1860.

ROSAMOND, J., TELANDER, K. M. ET LINN, S. (1979) J. Biol. Chimie. 254, 8646-8652.

WERLE, E., SCNEIDER C., RENNER, M., VÖLKER, M. ET FIEHN, W. (1994) Acides nucléiques résolutions 22, 4354-4355.

HANKE, M. ET C’EST UN CLIN D’ŒIL, M. (1994) BioTechniques 17, 858-860.