Invitrogen™ Cells-to-cDNA™ II Kit

Le Ambion™ Cells-to-cDNA™ II Kit (brevet en cours de brevet) produit de l’ADN c à partir de cellules de mammifères cultivées en moins de 2 heures. Aucune isolation d’ARN n’est requise. Ce kit contient suffisamment de réactifs pour 100 réactions et est idéal pour ceux qui souhaitent effectuer des réactions de transcription inverse sur un petit nombre de cellules, de nombreux échantillons cellulaires, ou pour les scientifiques peu familiers avec l’isolation de l’ARN.

• Aucune purification d’ARN requise
• Des cellules en culture à l’ADNc en moins de 2 heures
• Détection de messages rares dans aussi peu qu’une cellule
• Idéal pour les laboratoires non équipés pour l’isolement

d’ARNIdéal pour les applications
RT-PCR Le Cells-to-cDNA™ kit II (brevet en cours de brevet) intègre l’inactivation de la RNase et le traitement DNase I dans un tampon de lyse cellulaire compatible RT-PCR, éliminant complètement l’isolement de l’ARN. La plupart des tampons de lyse cellulaire contiennent de puissants dénaturants qui, s’ils sont transférés dans les réactions enzymatiques, inhiberaient ou inactiveraient la plupart des enzymes. Si un tampon de lyse sans dénaturants forts est utilisé, la RNase endogène peut rapidement dégrader l’ARN cellulaire. Le Cells-to-cDNA™ kit II contient un nouveau tampon de lyse cellulaire qui inactive les RNases endogènes sans compromettre les réactions enzymatiques en aval. Après l’inactivation des RNases, le lysat cellulaire peut être directement ajouté à une réaction de synthèse d’ADNc. Cells-to-cDNA™ II est compatible avec les protocoles RT-PCR en une et deux étapes.

Quantitatif—Résultats linéaires et absence de contamination
ADN détectable Pour illustrer la réponse quantitative et linéaire de Cells-to-cDNA™ II aux variations du nombre de cellules d’entrée, une expérience RT-PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l’aide du ABI système de détection de séquences 7700. En traçant le seuil de cycle (Ct) par rapport à la concentration cellulaire pour le GAPDH, on a donné une courbe standard avec une corrélation de 0,99. Ainsi, Cells-to-cDNA™ II donne des résultats linéaires pour 1 à 10 000 cellules/ μL dans un test RT-PCR en temps réel en deux étapes. Il convient également de noter que le contrôle PCR à modèle minus-modèle pour l’expérience GAPDH était négatif, indiquant un retrait complet de l’ADN génomique.

Procédure
simpleLe kit comprend tout ce dont vous avez besoin pour passer des cellules cultivées à l’ADN numérique prêt pour la PCR en moins de 2 heures; aucun isolement d’ARN n’est requis. Les cellules sont d’abord lavées avec PBS puis remises en suspension dans le tampon de lyse cellulaire. Un bref chauffage lyse simultanément les cellules et inactive les RNases. Une digestion optionnelle de la DNase est ensuite effectuée pour dégrader l’ADN génomique, suivie d’une étape d’inactivation thermique. Une fraction du lysat cellulaire est ensuite utilisée dans une réaction de transcription inverse avec les réactifs inclus.

Produits accessoires :
SuperTaq™ La polymérase à ADN thermostable Taq est recommandée et disponible séparément (Cat. Non. AM2050 et AM2052). Pour une amplification optimale de fragments supérieurs à 1 kb, utilisez SuperTaq™ la polymérase ADN thermostable Taq Plus (Cat. Non. AM2054 et AM2056).