Invitrogen™ Premo Essais d’autophagie avec les capteurs LC3B, p62 ou tandem RFP-GFP-LC3B

Premo Les capteurs d’autophagie exploitent les protéines associées à l’autophagie LC3B ou p62, ainsi que la GFP ou la RFP, pour détecter soit l’induction, soit l’inhibition de l’autophagie dans les cellules. Les capteurs d’autophagie Premo sont transduits à l’aide de la technologie BacMam (ulovirus Bacd’insecte avec un promoteur Mammalian), permettant une visualisation sans ambiguïté des protéines chimériques dans les autophagosomes. Les réactifs BacMam ne se réplicent pas dans les cellules de mammifères et sont donc sûrs à manipuler. Elles sont également non cytotoxiques et prêtes à l’emploi. Contrairement aux vecteurs d’expression typiques, les réactifs BacMam permettent une expression titrable et reproductible, et offrent une grande efficacité de co-transduction; par conséquent, plusieurs réactifs BacMam peuvent être facilement utilisés sur les mêmes cellules. Les améliorations récentes apportées au système BacMam permettent une transduction efficace dans une plus grande variété de cellules, y compris les neurones et les cellules souches neuronales (CSN), grâce à un protocole simple en une étape. Pour visualiser l’autophagie, il suffit d’ajouter le capteur d’autophagie BacMam aux cellules et de les incuber toute la nuit pour l’expression des protéines, puis de détecter le signal en utilisant les réglages standards de fluorescence GFP et/ou RFP sur votre instrument.

La protéine LC3B joue un rôle crucial dans l’autophagie. Normalement, cette protéine réside dans le cytosol, mais après clivage et lipidation avec la phosphatidylétanolamine, LC3B s’associe au phagophore. Cette localisation peut servir de marqueur général pour les membranes autophagiques. La protéine p62, également connue sous le nom de séquestosome (SQSTM1), est une protéine liant l’ubitiquitine qui agit comme un récepteur pour les cargaisons destinées à être dégradées par la machinerie autophagique cellulaire. Lorsque l’autophagie est induite, la protéine p62 se localise sur les autophagosomes et est ensuite dégradée. Inversement, avec l’inhibition de l’autophagie, la protéine p62 s’accumule dans l’autophagosome. Ainsi, la localisation subcellulaire d’une chimère protéique p62-fluorescente sert de marqueur utile pour l’induction et l’inhibition de l’autophagie.

De plus, en combinant la GFP sensible à l’acide (c’est-à-dire la GFP Emerald) avec une RFP insensible à l’acide (c’est-à-dire TagRFP) dans le capteur tandem RFP-GFP-LC3B, le passage d’un autophagosome (pH neutre) à l’autolysosome (avec un pH acide) peut être visualisé en imageant la perte spécifique de fluorescence de GFP lors de l’acidification de l’autophagosome après fusion lysosomale. Lors de l’induction de l’autophagie, le capteur d’autophagie Premo tandem marque les autophagosomes ponctués; ces structures sont positives pour la GFP et la RFP. Une fois que le lysosome a fusionné, le pH baisse, ce qui refroidit la GFP, faisant apparaître les autolysosomes rouges. De plus, la combinaison du Premo capteur tandem d’autophagie avec le rouge profond émetteur LysoTracker de rouge lointain (disponible séparément) permet une analyse en trois couleurs de la dynamique autophagosomal/autolysomal/lysosomal.

Chaque Premo kit de test d’autophagie contient du diphosphate de chloroquine, utilisé comme témoin négatif pour inhiber l’autophagie.

Avantages de l’utilisation Premo de tests
• d’autophagie : la combinaison du — Premo capteur tandem d’autophagie avec le rouge profond émetteur LysoTracker de rouge lointain permet une analyse en trois couleurs de la dynamique
• complète des voies autophagiques. Système —de délivrance très efficace > transduction à 90% d’une large gamme de lignées cellulaires de mammifères, incluant les cellules primaires, les cellules souches et les
neurones. Rapide et pratique—, • il suffit d’ajouter le Premo Réactif d’autophagie à vos cellules, incuber pendant la nuit, puis imager—ou stocker des cellules congelées prêtes à analyser pour une utilisation
• ultérieure Les — Premo réactifs d’autophagie robuste ne se réplicent pas dans les cellules de mammifères, n’ont pas d’effet cytopathique observable et conviennent aux protocoles
• de niveau de biosécurité (BSL) 1 Configurations multiples : — Premo Les capteurs d’autophagie sont disponibles dans les configurations chimériques suivantes :
P36235 : LC3B-GFP; contrôle LC3B (G120A)-GFP; P36236 : LC3B-RFP; commande LC3B (G120A)-RFP; P36239 : RFP-GFP-LC3B; P36240 : GFP-p62; P36241 : RFP-p62