Invitrogen™ EasySelect™ Kit d’expression Pichia

Le kit d’expression EasySelect™ Pichia fournit tous les composants nécessaires à la production de protéines chez la levure Pichia pastoris. Le EasySelect™ kit contient des souches de levure Picia , des vecteurs d’expression et des réactifs permettant la transformation des cellules de Picia . La sélection par Zeocin™ antibiotique facilite le dépistage des variants transformés à nombre élevé de copies.

Avantages du système d’expression Pichia pastoris :

• Cultivez les cellules de Pichia aussi facilement qu’E . coli
• Obtenir une densité cellulaire plus élevée que d’autres systèmes d’expression microbienne.
• Ils génèrent plus de protéines par cellule que les autres systèmes d’expression microbienne.
• Bénéficiez du traitement des protéines eucaryotes, du repliement des protéines et des modifications post-traductionnelles.
• Cela peut facilement passer des fioles à shake jusqu’à la fermentation à l’échelle industrielle.

Un système d’expression protéique éprouvé

Au cours des 30 dernières années, Pichia pastoris a été utilisée par des laboratoires et l’industrie à travers le monde pour produire des centaines de protéines différentes provenant de nombreuses espèces, y compris humaines (Réf. 1, 2, 3). Pichia pastoris peut être cultivée aussi facilement que les bactéries (E. coli) ou les levures (Saccharomyces cerevisiae), mais offre de nombreux avantages par rapport à ces systèmes (Réf. 4). Pichia pastoris peut atteindre des densités cellulaires beaucoup plus élevées que les bactéries ou autres levures. Pichia pastoris est capable de cultiver sur le méthanol comme seule source de carbone, ce qui rend la montée à l’échelle industrielle relativement peu coûteuse.

Le pouvoir du promoteur AOX1

Le EasySelect™ kit d’expression Pichia utilise le promoteur du gène Pichia alcohol oxydase 1 (AOX1) pour stimuler la production de votre protéine. Pichia pastoris est capable de cultiver grâce au méthanol comme seule source de carbone. Lorsqu’il est cultivé sur le méthanol comme seule source de carbone, l’ARNm AOX1 représente jusqu’à 5% de l’ARNm total et l’enzyme AOX1 peut représenter jusqu’à 30% du poids cellulaire (Réf. 5).

Le système d’expression EasySelect™ de Pichia est fourni avec les vecteurs pPICZ et pPICZα . Les vecteurs pPICZ et pPICZα contiennent un site de clonage multiple (MCS) et permettent l’insertion de votre gène d’intérêt sous le contrôle du promoteur AOX1. Les vecteurs pPICZ et pPICZα contiennent aussi une étiquette c-Myc pour une détection facile et une étiquette polyhistidine (6xHis) pour une détection et une purification faciles de votre protéine.

Puisque Pichia pastoris sécrète naturellement peu de protéines, vous pouvez utiliser la séquence de signalisation extracellulaire dans les vecteurs pPICZα pour forcer la sécrétion de votre protéine dans le milieu de culture afin de simplifier la purification en aval.

Obtenez l’intégration du nombre de copies élevées avec Zeocin™ l’antibiotique

Le EasySelect™ kit d’expression Pichia utilise l’antibiotique Zeocin™ pour sélectionner les cellules de Pichia transformées. Les vecteurs pPICZ et pPICZα contiennent le gène de la bléomycine de Streptoalloteichus hindustanus (Shble) qui confère une résistance aux Zeocin™ antibiotiques. Les vecteurs pPICZ et pPICZα peuvent être intégrés de façon stable dans le génome de Picia . En augmentant la concentration d’antibiotiques Zeocin™ , vous pouvez facilement sélectionner les clones avec le plus grand nombre d’intégrants et les niveaux d’expression protéique les plus élevés.

Le kit d’expression EasySelect™ Pichia contient les composants suivants :

• Piquez des fioles de Pichia pastoris et de souches d’E. coli pour démarrer vos cultures.
• Solutions pour fabriquer des cellules Pichia adaptées à la transformation.
• pPICZ et pPICZα vectors pour fusionner ton gène avec le promoteur AOX1.
• Amorces de séquençage pour confirmer l’insertion de votre gène dans les vecteurs pPICZ.
• Zeocin™ antibiotique pour sélectionner des cellules de Pichia transformées.

Références

1. Cereghino JL, Cregg JM. Expression protéique hétérologue chez la levure méthotrophe Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev. 2000 janvier; 24(1):45-66. [PubMed]

2. Cereghino GP, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM. Production de protéines recombinantes dans des cultures fermentatrices de la levure Pichia pastoris. Curr Opin Biotechnol. août 2002; 13(4):329-32. [PubMed]

3. Cregg JM. Introduction : distinctions entre Pichia pastoris et d’autres systèmes d’expression. Méthodes Mol Biol. 2007;389:1-10. [PubMed]

4. Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, Sunga J, Madden K, Chappell T. Expression chez la levure Pichia pastoris. Méthodes Enzymol. 2009;463:169-89. [PubMed]

5. Cregg JM, Madden KR, Barringer KJ, Thill GP, Stillman, CA. Caractérisation fonctionnelle des deux gènes de l’oxydase de l’alcool provenant de la levure Pichia pastoris. Mol Cell Biol. mars 1989; 9(3):1316-23. [PubMed]