Invitrogen™ Trousse de détection d’apoptose Apo-BrdU

La trousse de détection d’apoptose APO-BRDU™ comprend suffisamment de réactifs pour traiter un total de 60 suspensions de cellules, incluant :

• Suspensions de cellules témoins positives de 5 mL et 5 mL négatives d’environ 1 ×^{10 6} cellules par mL dans 70% (v/v) d’éthanol pour évaluer la performance des réactifs
• Tampons de lavage, de réaction et de rinçage pour traiter les étapes individuelles de l’essai
• L’enzyme terminale de la transférase désoxynucléotyl (TdT), le triphosphate de bromodoxyuridine (Br-dUTP) et l’anticorps anti-BrdU marqués par la fluorescéine pour le marquage des ruptures d’ADN
• Solution de iodure de propidium/RNase A pour contrer la coloration totale de l’ADN

L’une des caractéristiques les plus faciles à mesurer des cellules apoptotiques est la décomposition de l’ADN génomique par des nucléases cellulaires. Ces fragments d’ADN peuvent être extraits de cellules apoptotiques et provoquent l’apparition d’un échélisation de l’ADN lorsque l’ADN est analysé par électrophorèse en gel d’agarose. L’ADN des cellules non apoptotiques qui reste en grande partie intact ne présente pas cette échelisation sur les gels d’agarose lors de l’électrophorèse.

Le grand nombre de fragments d’ADN apparaissant dans les cellules apoptotiques entraîne une multitude de terminaisons 3-hydroxyles′ dans l’ADN. Cette propriété peut être utilisée pour identifier les cellules apoptotiques en marquant les extrémités 3-hydroxyle′ avec des nucléotides de désoxyuridine triphosphate bromolés (Br-dUTP). L’enzyme terminale désoxynucléotidyl transférase (TdT) catalyse une addition indépendante du modèle de triphosphates désoxyribonucléosides aux extrémités 3-hydroxyle′ de l’ADN double ou simple brin, avec des extrémités émoussées, en retrait ou en surplomb. Un nombre important de ces sites sont disponibles dans des cellules apoptotiques, fournissant la base de la méthode utilisée dans le APO-BRDU™ kit.

Des preuves récentes ont démontré que le Br-dUTP est plus facilement incorporé dans le génome des cellules apoptotiques que les triphosphates désoxynucléotidiques complexés avec des ligands plus gros comme la fluorescéine, la biotine ou la digoxigénine. Cette plus grande incorporation donne lieu à un signal de cytométrie en flux plus brillant lorsque les sites Br-dUTP sont identifiés par un anticorps monoclonal anti-BrdU marqué par la fluorescéine. Les cellules non apoptotiques n’incorporent pas de quantités significatives de Br-dUTP en raison de l’absence d’extrémités exposées à l’ADN 3-hydroxyle′.