Méthode multi-attributs pour le contrôle de la qualité dans la fabrication des protéines thérapeutiques
La méthode multi-attributs (Multi-Attribute Method ou MAM) est un processus de contrôle de la qualité émergent qui couple la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse précise à haute résolution (HRAM).
Les protéines thérapeutiques constituent une classe unique de médicaments à grosses molécules dont les structures sont beaucoup plus complexes que celles des médicaments à petites molécules. Au cours de leur fabrication et de leur stockage, ces protéines peuvent subir des modifications de structure primaire d’origine chimique ou enzymatique. Plus précisément, les modifications post-traductionnelles (MPT) peuvent contribuer à l’hétérogénéité globale qui fait partie des attributs de qualité du produit (AQP) des protéines thérapeutiques. Les modifications qui peuvent affecter l’efficacité et la sécurité du médicament sont classées comme attributs critiques du produit et doivent être surveillées à l’aide de divers processus de contrôle de la qualité (CQ).
L’un des principaux avantages de la MAM est qu’elle peut détecter les PTM au niveau des résidus d’acides aminés, ce qui n’est pas possible avec les méthodes conventionnelles de détection par UV ou fluorescence basées sur les profils. Le flux de travail MAM basé sur la LC-HRAM-MS implique une digestion enzymatique initiale de la protéine thérapeutique pour produire des peptides de différentes longueurs. Cette étape est suivie d’une séparation par gradient à l’aide de phases mobiles contenant de l’acétonitrile et de l’eau avec de l’acide formique ou de l’acide trifluoracétique comme modificateurs. L’analyse MS HRAM des peptides élués est utilisée pour déterminer les couvertures de séquence qui permettent d’identifier les PTM.
La MAM doit être robuste et validée en fonction des exigences réglementaires pour être utile aux méthodes de contrôle de la qualité dans l’industrie biopharmaceutique. De plus, les solvants et les réactifs de la phase mobile doivent être d’une grande pureté et sans contaminants interférents. Dans une étude récemment publiée sur le MAM, plus de 30 laboratoires leaders dans le domaine de la biopharmacie et de la LC-MS ont cité les artefacts chromatographiques et la contamination comme étant les deux principales causes d’anomalies de résultats dans la détection des pics.
La figure 1 montre un exemple de deux essais de contrôle (blanc) avec des phases mobiles préparées à partir de deux marques différentes d’acétonitrile de qualité LC-MS. La marque X présente un bruit de fond élevé qui pourrait compromettre la sensibilité et un motif de pic répétitif qui pourrait gravement interférer avec la détection des pics peptidiques. Les différences de masse de 44 Da suggèrent la présence de PEG ou de contaminants de type PEG. Tous les solvants de qualité LC-MS ne sont pas créés égaux, c’est pourquoi les solvants et les réactifs utilisés pour les phases mobiles doivent être évalués avant de mettre en œuvre les méthodes MAM.
Figure 1. Contrôles (vides) d’un MAM LC-MS utilisant deux marques d’acétonitrile de qualité LC-MS pour les phases mobiles : marque X (en haut en rose) et Thermo Scientific (en bas en bleu). La phase mobile est un gradient binaire de 0,1 % d’acide formique dans l’eau et de 0,1% d’acide formique dans l’acétonitrile. Les m/z des sept pics montrant des +44 Da de type PEG sont marqués en brun.
Thermo Fisher Scientific propose deux grades de produits chimiques entièrement testés pour les analyses LC HRAM MS MAM et autres analyses LC-MS. Les solvants et les mélanges LC-MS de qualité Optima de Fisher Chemical sont mélangés avec précision pour assurer la cohérence du lot et sont testés à l’aide de méthodes LC-MS. Les solvants Thermo Scientific de qualité UHPLC-MS répondent à des spécifications encore plus strictes pour les analyses qui exigent une plus grande sensibilité.
Les solvants et mélanges de qualité Optima LC-MS et UHPLC-MS ont été entièrement testés pour détecter les faibles impuretés organiques, y compris les substances de type PEG. Dans le nouveau flux de travail MAM 2.0 de Thermo Fisher Scientific, l’acétonitrile et l’eau de qualité UHPLC-MS sont spécifiés pour la préparation de la phase mobile pour le test initial d’évaluation des performances du système (SET).
