Nettoyage optique pour améliorer l’imagerie confocale de spécimens épais
Mise au point il y a près de 70 ans, la microscopie confocale est devenue un pilier de l’imagerie des échantillons biologiques marqués par fluorescence. La microscopie à grand champ éclaire les échantillons biologiques avec un champ lumineux diffus qui excite les fluorophores au-dessus et au-dessous du plan focal d’intérêt, ce qui donne une image floue et moins résolue. En plaçant un sténopé dans un plan focal conjugué entre l’échantillon et le détecteur de lumière (caméra ou PMT), la microscopie confocale bloque la lumière hors foyer contaminante, améliorant ainsi la résolution axiale (z) (Figure 1). Cette meilleure résolution signifie que des coupes Z plus fines peuvent être réalisées plus profondément dans des échantillons épais, tels que des sphéroïdes et des tissus réséqués, et que les relations biologiques tridimensionnelles peuvent être mieux élucidées.
Une qualité et une résolution d’image médiocres (par exemple, le rapport signal/bruit) peuvent résulter non seulement de l’excitation de fluorophores hors foyer, mais aussi de matières biologiques telles que les lipides et les protéines. Dans ce dernier cas, la lumière focalisée se diffracte lorsqu’elle traverse l’échantillon, ce qui réduit la quantité de signal détecté. Cet effet de diffraction est quantifié par l’indice de réfraction, qui est une mesure de l’influence de la vitesse de la lumière lorsqu’elle traverse un matériau. Faire correspondre autant que possible l’indice de réfraction du milieu de montage et de l’échantillon avec l’optique du microscope permettra de minimiser la lumière diffractée, ce qui améliorera la qualité de l’image.
Figure 1 Voir les références ci-dessous.
De nombreux agents de blanchiment et milieux de montage ont été développés pour aider à réduire la lumière diffractée en modifiant l’indice de réfraction de l’échantillon afin qu’il corresponde mieux à l’indice de réfraction de l’optique du microscope. La sélection de l’agent de blanchiment le plus approprié nécessite la prise en compte de multiples facteurs, notamment l’épaisseur de l’échantillon, la profondeur d’imagerie, le type de fluorophore, ainsi que le format et le matériau du vaisseau.
Figure 2 Voir les références ci-dessous.
Certains agents nettoyants fonctionnent en remplaçant simplement l’environnement intracellulaire, principalement composé d’eau, par un liquide dont l’indice de réfraction est mieux adapté, comme le glycérol. Par ailleurs, certains agents de clarification améliorent la clarté de l’échantillon en extrayant les lipides (dégraissage). Les agents nettoyants qui échangent simplement l’environnement aqueux intracellulaire sont peu invasifs et tendent à favoriser les échantillons plus petits et ceux où des protéines fluorescentes sont utilisées. Bien que les agents de nettoyage dégraissants puissent améliorer la profondeur d’imagerie dans une plus grande mesure, ces agents utilisent généralement des détergents puissants et des dispositifs électrophorétiques pour éloigner les lipides de l’échantillon.
Certains agents de clarification dégraissants utilisent des solvants organiques, qui peuvent être incompatibles avec les échantillons à base de protéines fluorescentes. En outre, les agents de nettoyage à base de solvants organiques peuvent ne pas être compatibles avec les récipients d’imagerie qui utilisent des substituts du verre comme fenêtre d’imagerie, telle que la cyclooléfine. Cette note technique décrit l’utilisation d’un agent de clarification corrigeant l’indice de réfraction (Figure 2) pour améliorer la profondeur d’imagerie d’échantillons épais tels que les sphéroïdes HT-1080.
Préparation d’échantillons pour l’imagerie des sphéroïdes HT1080
Les sphéroïdes HT-1080 ont été formés par l’ensemencement de 1000 cellules dans des plaques de 96 puits à fond en U à fixation ultra-faible (ULA), n° 4520, de Corning, et ont été laissés coalescer pendant 24 heures dans le DMEM Gibco Advanced de Thermo Fisher Scientific à 37 °C. Les sphéroïdes ont ensuite été transférés dans des plaques 96 puits transparentes à fond plat, n° 204626, d’Agilent Technologies (1 sphéroïde par puits) et laissés se déposer et établir l’adhésion à température ambiante pendant une heure. Les plaques contenant les sphéroïdes ont ensuite été transférées dans l’incubateur à 37 °C et on les a laissées se fixer à la zone de culture et s’étendre pendant la nuit. Les sphéroïdes attachés avec des régions cellulaires en migration ont été fixés avec du PFA à 4 % pendant 30 minutes, puis perméabilisés avec du PFA à 0,5 % pendant une heure. Pour obtenir une pénétration totale des colorants, les sphéroïdes ont été colorés avec du Hoechst 34580 et de l’Alexa Fluor 488-phalloïdine pendant une nuit à 4 °C. Les sphéroïdes ont ensuite été lavés et le PBS a été maintenu ou remplacé par un milieu de montage maison (80 % de glycérol, 20 mM de tris, pH 8,0, 0,5 % de gallate de n-propyle, 0,05 % de NaN3) ou le ScaleS4 (40 % de D-sorbitol, 10 % de glycérol, 4M d’urée, 15 % de DMSO, 0,5 % de gallate de n-propyle, 0,05 % de NaN3) (Figure 1).
Procédure d’imagerie et traitement
Les images confocales et les images en Z à grand champ des sphéroïdes HT-1080 fixés ont été capturées à 40x à l’aide du lecteur d’images confocales Cytation C10 et du logiciel Gen5 en mode manuel (IMM). La gamme dynamique de chaque canal a été maximisée en sélectionnant le bouton « montrer les pixels saturés ». Les paramètres d’exposition de chaque canal ont été ajustés de manière à ce qu’ils soient dans la fourchette et qu’il n’y ait pas de pixels saturés. La plage Z a été déterminée en basculant sous et au-dessus de l’échantillon jusqu’à ce que la structure d’intérêt (dans cet exemple, un sphéroïde) perde de son intensité.
La taille des pas en Z a été définie en utilisant les recommandations d’échantillonnage de Nyquist; pour l’imagerie d’Alexa Fluor 488 à l’aide de l’objectif à air 40x (NA = 0,6), les tailles des pas ont été déterminées comme étant de 1 µm pour le champ large et de 0,6 µm pour le confocal. Les images ont ensuite été soumises à cinq itérations de déconvolution en utilisant une fonction d’étalement de point basée sur l’objectif. Les images déconvoluées ont ensuite été prétraitées pour réduire le signal de fond. La taille de la boule roulante pour la réduction du fond pour le Hoechst 34580 (canal DAPI) et l’Alexa Fluor 488-phalloïdine a été fixée à 25 et 50 µm, respectivement. Les hauteurs Z équivalentes pour les trois conditions (PBS, glycérol à 80 %, ScaleS4) ont été comparées pour déterminer les limites de profondeur d’imagerie (Figure 2).
La microscopie confocale est un mode d’imagerie puissant qui améliore la qualité des images en supprimant la lumière hors foyer. Cependant, les sources de lumière fluorescente diffractée inhérentes à l’échantillon empêchent cette amélioration d’être réellement réalisée. L’utilisation d’agents de clarification permet de faire correspondre l’indice de réfraction de l’échantillon, dans ce cas les sphéroïdes HT-1080, avec l’indice de réfraction du système optique, ce qui permet d’améliorer la profondeur et la résolution de l’imagerie.
References
- Figure 1. Sphéroïdes HT-1080 collés. Les sphéroïdes HT-1080 de 1000 cellules ont été fixés et colorés avec du Hoechst 33342 et de l’Alexa Fluor 488-phalloidine, puis le tampon (PBS) a été maintenu ou échangé contre l’agent de clarification ScaleS4 ou du glycérol à 80 %. Les piles Z ont ensuite été capturées à 20x (0,45NA) en mode grand champ ou confocal (disque de 60 µm). Des projections d’intensité maximale de la pile Z entière ont ensuite été générées.
- Figure 2. Limites de profondeur d’imagerie des sphéroïdes HT-1080 adhérés dans différents milieux d’imagerie. Les tranches Z de chaque sphéroïde adhérent de la Figure 1 ont été sélectionnées lorsque les noyaux deviennent non résolubles pour le PBS (panneaux supérieurs), ou pour le ScaleS4 ou le glycérol à 80 % (panneaux inférieurs).
